基于斑马鱼模型评价二甲基姜黄素黄芩苷

摘要：目的评价二甲基姜黄素、黄芩苷、紫檀茋对异烟肼导致斑马鱼神经损伤的保护作用。方法挑选受精后2h（2hpf）的斑马鱼胚胎，设置对照组（胚胎培养用水处理）、异烟肼组（4mmol/L）、二甲基姜黄素（0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L）组、黄芩苷（0.1、0.2、0.5、1.0μmol/L）组、紫檀茋（0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L）组，异烟肼分别与不同浓度的药物共处理h，用Zebrabox斑马鱼行为分析仪分析斑马鱼幼鱼行为学轨迹变化，荧光显微镜下观察斑马鱼幼鱼多巴胺神经元的发育情况。结果与对照组比较，异烟肼组运动轨迹明显减少，运动总距离和低速、中速运动距离均显著下降（P＜0.01），运动速度明显降低；神经节长度显著降低（P＜0.01）。与异烟肼组比较，二甲基姜黄素组运动轨迹明显增加，斑马鱼运动状态主要为低速运动，各浓度的二甲基姜黄素组斑马鱼总运动距离和低速运动距离均显著增加（P＜0.01），运动速度明显增加，0.5、2.0、4.0μmol/L的二甲基姜黄素组中速运动距离显著增加（P＜0.01）；黄芩苷组运动轨迹明显增加，0.1、0.2、0.5和1.0μmol/L的黄芩苷组斑马鱼总运动距离和低速运动距离均显著增加（P＜0.01），运动速度明显增加；0.5和1.0μmol/L紫檀茋组运动轨迹明显增加，紫檀茋0.5μmol/L组的总运动距离和低速运动距离均显著增加（P＜0.01），紫檀茋0.5和1.0μmol/L浓度组运动速度明显增加。与异烟肼组比较，二甲基姜黄素和黄芩苷各浓度组多巴胺相对神经节长度显著增加（P＜0.01）；紫檀茋1μmol/L组相对神经节长度显著增加（P＜0.01）。结论二甲基姜黄素、黄芩苷和0.5、1.0μmol/L紫檀茋对异烟肼导致的斑马鱼神经损伤有明显保护作用。

异烟肼具有良好的抗结核杆菌作用［1-2］，是治疗结核病的一线药物［3］。但随着异烟肼的广泛使用，其不良反应也日益凸显，包括肝毒性［4］、免疫系统反应［5］、中枢神经系统损伤［6-7］等，其中中枢神经系统损伤是异烟肼的主要不良反应之一。中枢神经系统损伤临床表现以癫痫、周围神经炎、昏迷等为主［8］，损伤程度与剂量有关［9］。勇彤［10］研究发现异烟肼治疗结核病患者后可诱发癫痫样症状，引起患者神经损伤。Liu等［11］研究表明，异烟肼对斑马鱼胚胎有明显的神经毒性，异烟肼可导致斑马鱼自主运动能力显著降低，多巴胺神经元长度显著减少，脑部发育受到抑制。

二甲基姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种多酚类物质，已有研究证实其在神经系统疾病的治疗中有较好效果。二甲基姜黄素主要通过调节体内氧化还原平衡，减少氧化应激造成的损伤发挥神经保护作用［12］。也有研究发现其可能主要通过抑制Caspase-3蛋白的表达发挥神经保护作用［13］。黄芩苷是黄芩中主要的活性物质，刘萍等［14］发现黄芩苷可通过促进热休克蛋白70（HSP-70）的表达，抑制Caspase-3的表达，对大鼠缺血性脑损伤发挥保护作用。紫檀茋是一种植物雌激素，主要来源于蓝莓和葡萄籽，有动物实验证实脑缺血大鼠服用紫檀茋后，其脑组织内存活神经元的数量显著增加［15］。给予衰老大鼠紫檀茋后，大鼠学习和记忆能力均明显提高［16］。

斑马鱼与哺乳动物一样，具有所有主要的神经介质系统，包括神经递质受体、转运蛋白以及合成和代谢的酶［17］。研究人员对斑马鱼基因组测序发现斑马鱼与人类基因相似度高达87%［18］。斑马鱼具有体型小、发育快、繁殖率高、胚胎透明等特点［19］，适合药物活性成分的快速筛选［20］。因此，本实验以新型模式生物斑马鱼为模型，评价二甲基姜黄素、黄芩苷、紫檀茋对异烟肼导致斑马鱼神经损伤的保护作用，为这3种化合物在神经保护方面的应用提供数据参考。

1　材料

1.1　试剂

二甲基姜黄素、黄芩苷、紫檀茋、异烟肼由美国Fluka公司提供；三卡因由美国Sigma公司提供（使用双蒸水配成质量分数0.16%的溶液，4℃冰箱保存备用）；胚胎培养用水（5mmol/LNaCl、0.17mmol/LKCl、0.4mmol/LCaCl2、0.16mmol/LMgSO4）。

1.2　主要仪器

斑马鱼饲养养殖系统（北京爱生有限公司）；Zebrabox斑马鱼行为分析仪（法国Viewpoint公司）；体视荧光显微镜（德国ZEISS公司）；CO2培养箱（美国Forma公司）。

1.3　实验动物

野生AB品系斑马鱼、绿色荧光标记多巴胺神经元的转基因斑马鱼Tg（vmat：GFP）由山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台提供，其饲养和繁殖方法可参考文献报道的成熟方法［21］。成鱼在斑马鱼养殖系统中饲养，实验前1天取健康斑马鱼按照雌雄比例为1∶1或1∶2放入缸中交配，次日获得受精卵，将受精卵清洗3遍后，将其置于含有0.02%亚甲基蓝的的胚胎培养用水，28.5℃条件下生化培养箱中孵育（照明14h/黑暗10h）。定期更换胚胎培养用水。

2　方法

2.1　处理斑马鱼胚胎方法

邬芳艳等［22］评价了异烟肼对斑马鱼胚胎的神经发育毒性，其中4、8mmol/L异烟肼神经毒性较为明显，且4mmol/L异烟肼致死率较低。因此，选取4mmol/L异烟肼作为本实验的造模浓度。在显微镜下随机挑选发育至正常的受精后2h（2hpostfertilization，2hpf）斑马鱼胚胎，每孔30枚，放于6孔板中。实验设置对照组（胚胎培养用水处理）、异烟肼组（4mmol/L）、二甲基姜黄素（0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L）组、黄芩苷（0.1、0.2、0.5、1.0μmol/L）组、紫檀茋（0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L）组，异烟肼分别与不同浓度的药物共处理。每个浓度设置3个复孔，溶液终体积均为5mL，置于恒温（28.5℃）培养箱中继续光控培养至h。每24小时更换药液，实验重复3次。

2.2　斑马鱼幼鱼行为学分析

连续给药处理h后，将幼鱼用胚胎培养用水清洗2～3遍。分别在各组中随机挑选12条幼鱼并将其置于48孔板中，每孔1条，胚胎培养用水μL/孔。将孔板放入斑马鱼行为学分析暗箱中，让幼鱼适应15min，在安静的环境下使用Zebralab采集30min内各组斑马鱼的运动轨迹［23］。根据斑马鱼幼鱼的游动速率将运动划分为3个速度范围：低速（＜2cm/s）、中速（2～5cm/s）和高速（＞5cm/s）［24］。计算斑马鱼运动总距离、分时速度以及运动的低速和中速距离。实验重复3次。

2.3　斑马鱼幼鱼多巴胺神经元检测

连续给药处理h后，每个浓度组随机挑选10条绿色荧光标记多巴胺神经元的转基因斑马鱼Tg（vmat：GFP），将其用甲基纤维素固定于载玻片上（背部朝上），荧光显微镜下拍摄各浓度组斑马鱼幼鱼多巴胺神经节，使用Image-ProPlus5.1软件（MediaCybernetiosInc，Rocjvile，MD）统计多巴胺神经节的长度，计算相对对照组神经节长度。

2.4　统计学分析

数据统计使用±s表示，所有结果均通过SPSS16.0统计软件进行分析，样本差异通过One-wayANOVA计算。

3　结果

3.1　二甲基姜黄素、黄芩苷、紫檀茋对异烟肼引起的斑马鱼行为学变化的影响

3.1.1　二甲基姜黄素对异烟肼引起的斑马鱼行为学变化的影响如图1-A所示，异烟肼组较对照组运动轨迹明显减少，连续给药h后，二甲基姜黄素组运动轨迹较异烟肼组明显增加。如图1-B、C所示，斑马鱼运动状态主要为低速运动，与对照组比较，异烟肼组运动总距离和低速、中速运动距离均显著下降（P＜0.01）；与异烟肼组比较，0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L二甲基姜黄素组斑马鱼总运动距离和低速运动距离均显著增加（P＜0.01），0.5、2.0、4.0μmol/L二甲基姜黄素组中速运动距离显著增加（P＜0.01）。如图1-D所示，异烟肼组较对照组运动速度明显减少，二甲基姜黄素组运动速度较异烟肼组明显增加。4μmol/L组斑马鱼运动能力恢复效果较好，基本与对照组相同。

3.1.2　黄芩苷对异烟肼引起的斑马鱼行为学变化的影响如图2-A所示，异烟肼组较对照组运动轨迹明显减少，连续给药h后，黄芩苷组运动轨迹较异烟肼组明显增加。如图2-B、C所示，与对照组比较，异烟肼组运动总距离和低速运动距离均显著下降（P＜0.01）；与异烟肼组比较，0.1、0.2、0.5、1.0μmol/L的黄芩苷组斑马鱼总运动距离和低速运动距离均显著增加（P＜0.01），且作用呈剂量相关性。如图2-D所示，异烟肼组较对照组运动速度明显减少，黄芩苷组运动速度较异烟肼组明显增加。

3.1.3　紫檀茋对异烟肼引起的斑马鱼行为学变化的影响如图3-A所示，异烟肼组较对照组运动轨迹明显减少，连续给药h后，0.5、1.0μmol/L紫檀茋组运动轨迹较异烟肼组明显增加。如图3-B、C所示，与对照组比较，异烟肼组运动总距离和低速、中速运动距离均显著下降（P＜0.01）；与异烟肼组比较，紫檀茋0.5μmol/L组的总运动距离和低速运动距离均显著增加（P＜0.01），如图3-D所示，异烟肼组较对照组运动速度明显减少，紫檀茋0.5、1.0μmol/L浓度组运动速度较异烟肼组明显增加。

3.2　二甲基姜黄素、黄芩苷、紫檀茋对异烟肼引起的斑马鱼多巴胺神经元发育毒性的影响

如图4所示，与对照组比较，异烟肼组多巴胺相对神经节长度显著降低（P＜0.01）；与异烟肼组比较，二甲基姜黄素和黄芩苷各剂量组多巴胺相对神经节长度显著增加（P＜0.01）；紫檀茋1μmol/L组相对神经节长度显著增加（P＜0.01）。

4　讨论

异烟肼是一种具有强效抗菌作用的药物，分子量小，脂溶性高，易于透过血脑屏障。异烟肼进入脑内，可通过干扰多巴胺信号通路的传导与表达造成神经元细胞的损坏和凋亡［22］。目前，临床上防治异烟肼神经毒性的药物种类较少，筛选出具有神经保护功能的化合物将为临床上防治异烟肼引起的神经损伤提供新的解决方案。

斑马鱼作为模式生物在神经表型研究、神经系统药物筛选及神经系统疾病的研究中有明显优势［24］。斑马鱼在5dpf即可自主运动，利用斑马鱼行为检测仪可以分析化合物对斑马鱼行为能力的影响。徐彤等［25］通过分析斑马鱼行为证明了四溴双酚醚（-羟基乙基）醚（TBBPA-DHEE）对胚胎自主运动的抑制作用。王荣春等［26］利用Zebrabox分析斑马鱼行为能力，评估了芪智消渴颗粒对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的神经损伤的保护作用。因此，斑马鱼行为能力可作为反映神经损伤和恢复的指标之一［25］。本实验中，异烟肼处理的斑马鱼表现出行为能力降低的特点，给予二甲基姜黄素后发现斑马鱼运动能力明显恢复，游泳距离增加，平均速度变快且主要以低速运动。随着二甲基姜黄素浓度的增加和作用时间的延长，1、2、4μmol/L组呈现一定的剂量相关性。同样，黄芩苷也表现出明显的神经保护作用，可以使异烟肼诱导的斑马鱼运动能力、平均速度得到恢复。以上各检测结果均与之前的报道一致［27］。但是，本实验中紫檀茋对斑马鱼神经保护效果明显低于相同浓度的二甲基姜黄素和黄芩苷（0.5、1μmol/L），且2和4μmol/L浓度的紫檀茋没有对异烟肼造成的斑马鱼神经损伤起到保护作用，所以紫檀茋浓度范围还需进一步摸索。

多巴胺神经元是评价神经发育的一个关键指标［28］。郝广萍等［29］在研究牡丹籽油微囊粉的抗帕金森病活性时，以多巴胺神经元缺失症状的减轻说明牡丹籽油微囊粉可以缓解帕金森病症状。朱晓宇等［30］在选用如意珍宝丸治疗吗替麦考酚酯诱导的斑马鱼中枢神经损伤时，以多巴胺神经元长度作为检测指标，对神经元长度的延长说明如意珍宝丸对斑马鱼神经损伤的保护作用。斑马鱼多巴胺神经元在斑马鱼发育24h时开始形成，30h时开始分化，利用荧光标记的多巴胺神经元转基因斑马鱼，可在荧光显微镜下直接观察药物对多巴胺神经元生长的影响［30］。本实验以绿色荧光标记多巴胺神经元的转基因斑马鱼为实验对象，观察斑马鱼神经元发育情况，结果表明二甲基姜黄素、黄芩苷、紫檀茋可以有效改善异烟肼导致斑马鱼多巴胺神经元长度的缺失，表明这3种化合物对异烟肼导致的斑马鱼神经损伤有一定的保护作用。

本实验以斑马鱼运动行为、多巴胺神经元发育情况为指标，评价了二甲基姜黄素、黄芩苷和紫檀茋对异烟肼导致的斑马鱼神经损伤的保护作用。其中二甲基姜黄素（0.5、2.0、4.0μmol/L）与黄芩苷（0.1、0.2、1.0μmol/L）对神经保护效果较好，安全性较高。这将为筛选防治异烟肼神经损伤的化合物提供科学依据，但是这3种化合物对异烟肼导致斑马鱼神经损伤的保护机制还需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：杨亚楠，邬芳艳，王西新，刘可春，柳丽，张云．基于斑马鱼模型评价二甲基姜黄素、黄芩苷、紫檀茋对异烟肼导致神经损伤的保护作用[J].药物评价研究,,44(7):-.