斑马鱼模型研究自噬及其在骨骼发育和疾病中
摘要：
在过去的二十年中，大大增加了以斑马鱼为模型生物的研究。斑马鱼具有许多优点，如高繁殖力、光学透明性、体外发育和遗传易学性，非常适合研究发育过程和遗传突变的影响。最近，斑马鱼模型已被用于研究自噬。在许多情况下，细胞和组织的体内平衡都需要这一重要的蛋白质降解途径。相应地，其失调与多种疾病有关，包括骨骼疾病。在这篇综述中，我们探讨了斑马鱼是如何被用于研究骨骼发育和疾病的自噬，以及这些领域相互交叉的方式，以帮助确定潜在的骨骼疾病治疗靶点。
自噬：自噬是一种分解代谢过程，通过溶酶体的降解，使细胞溶质组分分解为基本的生物分子组分，从而使其可循环利用。这是细胞分化过程中必不可少的过程，它有助于维持细胞稳态，其主要功能是在压力下调动营养以维持重要的细胞功能。为了了解自噬途径及其分子控制，已经进行了广泛的研究。虽然这些研究已经确定了自噬在细胞分化和存活中的重要性，但也强调了自噬在许多疾病中所起的重要作用，以及自噬失调是如何导致多种疾病的病理学，包括常见的骨骼疾病，如关节炎和骨质疏松症。自噬可以分为三种主要形式。伴侣介导的自噬（CMA），微自噬和大自噬；每一种都通过向溶酶体运送货物的方法来描述。这篇综述将集中于宏观自噬（以下称为自噬），因为这被认为是自噬的主要形式，并且仍然是研究最广泛的。自噬体是独特的双膜结构，在与溶酶体融合形成降解的自溶酶体之前会捕获蛋白质，细胞器和其他细胞碎片。胞质组分的这种隔离可以作为非选择性或选择性过程进行，前者被认为是大量的非特异性降解过程，而后者则需要特定的受体蛋白来识别和隔离靶蛋白，分子，细胞器或入侵病原体。
自噬机制：自噬途径主要由高度保守的自噬相关（ATG）蛋白家族介导，这是由YoshinoriOhsumi及其同事在发芽酵母中首次发现并鉴定的。迄今为止，在酵母中已鉴定出40多个ATG，其中大部分在高等真核生物中保存。大致而言，该途径可分为三个主要步骤：吞噬体的起始和形成；吞噬体伸长；最后是溶酶体融合。在每一个步骤中，专门的ATG蛋白和复合物被招募和激活在不同的吞噬体组装点，称为自噬体起始点。当新生的自噬体被扩张、封闭并运输到溶酶体时，来自其他细胞膜运输途径的蛋白质起着重要作用。我们将专注于到目前为止与斑马鱼自噬模型相关的核心蛋白的哺乳动物生物学。其中包括，ULK1，ATG13，FIP和ATG组成的ULK1复合物，以及包含VPS34，Beclin1（BECN1），ATG14，AMBRA1和p的磷脂酰肌醇3-激酶复合物I（PI3KC3），它们参与自噬起始和吞噬功能的形成。接下来，两个结合系统：ATG5-ATG12-ATG16L和MAP1LC3-ATG3协同募集MAP1LC3并将其偶联到存在于荧光团膜上的脂质磷脂酰乙醇胺（PE）上，形成脂质化的MAP1LC3-II。在此步骤之前，ATG4和ATG7负责将MAP1LC3加工成MAP1LC3-I，以进行脂质偶联。这些步骤对于自噬的检测和分析至关重要，因为荧光标记的MAP1LC3是监测细胞和整个生物体内自噬活性的最常用标记。最后，在选择性自噬的情况下，受体蛋白（例如p62/SQSTM-1，optineurin和NDP52）可以特异性识别并将多泛素化的物质靶向自噬体。
斑马鱼自噬途径中涉及的核心蛋白及其调控，敲除（KO）斑马鱼品系用红色突出显示，方框显示常用药物，可以激活（绿色）或抑制（红色）自噬活动
除了这些蛋白质，还有许多其他信号通路参与启动自噬反应。其核心是雷帕霉素复合物1（mTORC1）途径和cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）途径的机制靶标。从对不同生物的各种研究中可以明显看出，自噬起始的正确调节对于维持细胞稳态是必不可少的。许多研究表明自噬失调与多种神经、心血管、代谢以及最近的骨骼疾病的发展有关。同时，其他研究发现了自噬机制介导的蛋白质降解以外的其他细胞功能的多样性。这些过程包括细胞分化和增殖，细胞代谢，内质网应激缓解和非细胞自主营养物动员等过程，所有这些过程对于骨骼和软骨细胞的发育和存活都是必不可少的。通过了解自噬在特定细胞中的独特功能及其调控的关键因素，我们可以更好地掌握自噬在骨骼疾病发展过程中的影响，以及如何操纵自噬途径以达到治疗目的。
自噬与骨骼发育：多项研究表明自噬与骨骼系统的发育和维持有关。从发育的早期开始，自噬在关键骨骼细胞的分化，转化和功能活性中起着至关重要的作用，这些骨骼细胞包括成骨细胞（骨骼分泌细胞），破骨细胞（骨骼吸收细胞），骨细胞（骨骼维持细胞）和软骨细胞（软骨分泌细胞）。发育后的新证据表明，这些细胞一旦最终分化，就需要组成型水平的基础自噬，以确保它们所处的低氧，营养缺乏和高渗环境中的正常功能和存活。
自噬在骨骼和软骨细胞中的作用概述，自噬有助于维持成骨细胞，破骨细胞，骨细胞和软骨细胞的稳态，存活和功能
在胚胎发育过程中，脊椎动物骨骼及其相关的骨、软骨和结缔组织是由间充质干细胞（MSCs）形成的。这些细胞最初由三个不同的胚胎细胞系衍生而来的，继续形成骨骼的不同区域。为了形成骨骼，这些细胞首先迁移到胚胎内的适当区域进行骨骼形成，然后聚集并增殖形成间充质，随后分化为成骨细胞或软骨细胞。研究强调了自噬在MSCs分化过程和分化能力中的重要作用。骨髓间充质干细胞已被证明具有高水平的基础自噬，用阻止自噬诱导的III类pi3激酶抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理幼鼠骨髓间充质干细胞后，显示其分化为成骨细胞的能力降低。此外，对原代人骨髓间充质干细胞的研究表明，在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中，这些细胞积累了大量自噬空泡，这些空泡随后被分解提供能量。在分化过程中需要自噬来帮助平衡能量供应，因此它对MSC的分化和功能至关重要。利用原代小鼠成骨细胞进行的体外研究还表明，通过敲除哺乳动物ULK1复合物的重要成分FIP来阻断自噬，抑制成骨细胞分化，进一步证明了自噬在建立成骨细胞群中的重要性。骨是由成骨细胞和软骨细胞通过两种不同的机制形成的。在膜内骨化过程中，骨是由成骨细胞直接分泌的，而成骨细胞是斑马鱼颅面骨骼、脊柱和鳍的主要组成部分。随着生物体的发育，骨骼会加长并建模，直到形成最终的骨骼，尽管骨骼在整个生命过程中会不断响应机械负荷或骨折的变化而不断重塑。骨建模和重塑的过程由成骨细胞，破骨细胞和骨细胞介导。成骨细胞位于骨骼表面，负责骨骼基质的合成，分泌和矿化。同时，破骨细胞迁移到活跃的骨重建区域，帮助降解和吸收骨。这些细胞的协调活动对于确保骨内稳态至关重要，因为这种平衡受到干扰会导致疾病。自噬是已经证明对于维持这种平衡以及调节骨骼和软骨细胞的分化，形成和功能至关重要的过程。
骨形成中的自噬：成骨细胞是骨形成的主要细胞类型，其生存和功能均受自噬调节。骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化受转录因子RUNX2和SP7（也称为Osterix）的调控。在这个过程中，研究表明自噬被上调以帮助这些细胞在缺氧的骨环境中生存并对抗氧化应激，因为控制自噬活性水平与成骨细胞存活呈正相关。除了生存，自噬活动与成骨细胞矿化密切相关。成骨细胞通过将羟基磷灰石晶体沉积到胶原基骨基质中形成矿化骨。随着基质的成熟，这些晶体在胶原中形成晶格结构，形成骨骼。除此之外，ATG5、ATG7或Beclin1的缺失，对自噬体的形成是必不可少的，它们都被证明会导致骨量减少和矿化。在小鼠靶向性ATG7丢失的情况下，记录到骨折数量的增加，并提示与内质网应激和成骨细胞数量减少有关。另一项体外研究表明，成骨细胞中FIP的缺失会破坏其终末分化，抑制骨形成并导致骨质减少。
自噬在骨维持中的作用：骨细胞是由成骨细胞形成的终末分化细胞，成骨细胞被困在骨基质中。它们对骨骼健康和维持至关重要，并负责调节骨骼重塑过程。通过在骨基质内扩展类树突状过程，骨细胞连接形成一个庞大的网络，该网络通过引导成骨细胞和破骨细胞募集到局部骨区域来检测并响应骨环境中的激素和机械变化。正如自噬在成骨细胞分化和功能中起着关键作用一样，自噬对骨细胞的健康和维持也有重要作用。首先，在成骨细胞向骨细胞的转化过程中，细胞必须经历细胞形态和成分的巨大变化，这就需要细胞器的积极循环。其次，一项使用人和大鼠骨骼组织的研究表明，骨细胞显示出MAP1LC3点状细胞的积累，并且这种表达在骨细胞中比成骨细胞高。
自噬在软骨形成和维持中的作用：除骨细胞外，形成软骨的软骨细胞在骨骼发育和功能中也起着至关重要的作用。软骨细胞负责在软骨内骨化过程中形成最初的软骨骨架和骨间的关节软骨层，使关节液运动。与其他骨骼细胞群一样，自噬已被证明是软骨细胞分化、功能和存活的重要过程。在软骨内骨形成过程中，软骨细胞通过分泌富含胶原蛋白的基质形成未来骨骼的软骨。这个过程一直持续到软骨细胞达到非增生，肥大状态，此时细胞经历凋亡，触发软骨的吸收并通过侵袭成骨细胞使其矿化成骨。一些软骨细胞保留在靠近形成骨的末端的区域内，称为生长板，在该区域中，软骨细胞继续增殖并分泌软骨基质，从而能够通过骨化而纵向生长。软骨细胞特异性缺失ATG7的小鼠由于在内质网内保留合成的II型前胶原而显示基质分泌受损。
斑马鱼作为模型研究骨骼发育和病理过程中的自噬：如上所述，自噬在骨和软骨细胞的发育和维持中起着重要作用，其活性对于维持骨骼内环境稳定至关重要。事实上，由于骨骼或软骨细胞活性的不平衡以及伴随的自噬活性失调，引发了多种骨骼疾病。这些疾病中有许多是慢性的和使人衰弱的，目前可供选择的治疗方法有限。因此，扩大我们对协调骨骼和关节发育（例如自噬）至关重要的细胞和分子过程的理解，对于促进这些疾病的新疗法的发展以及扩大我们对这些疾病的发病机理理解至关重要。通过使用动物模型，已经学到了很多有关骨骼系统及其相关疾病的知识。在骨骼研究中，体内模型比体外细胞模型具有明显的优势，因为骨骼和关节的复杂、可移动、三维结构无法在体外系统中完全重现。同样，其他细胞和组织类型及其相关分泌物对软骨和骨细胞的作用也无法在单细胞系统中重新捕获。尽管许多不同的动物已被用作骨骼研究的模型，但小鼠模型仍然是最广泛使用的模型，因为它饲养成本普遍较低，生成时间短，易于处理和遗传易处理性。尽管有这些优点，但啮齿类动物模型在基于骨骼和自噬的研究中确实存在一些固有的局限性。
斑马鱼被认为是研究骨骼和自噬的啮齿动物模型的一个有用的替代品。首先，斑马鱼的繁殖能力很强，一对斑马鱼一周能产下个卵，这些卵在外部发育成半透明的幼虫。这样就可以研究早期发育过程中细胞和大体形态的变化，而不需要侵入性实验技术或动物牺牲。其次，斑马鱼具有很强的遗传适应性，因为通过使用TALEN和CRISPR/Cas9等遗传工具，可以在单细胞阶段向胚胎注射构建物，从而产生转基因或转基因斑马鱼系。随着这些工具的不断完善以及获得完整测序基因组的途径，斑马鱼有可能以高通量的方式高效，特异性地靶向多个基因。通过这种方法，已经开发出许多基因敲除和报告基因系，并用于模拟特定疾病或可视化和追踪特定蛋白质或细胞类型，例如骨细胞或自噬相关蛋白质。作为脊椎动物，斑马鱼与人类之间显示出高度的遗传相似性，并且所有与哺乳动物自噬相关的核心蛋白质都可以在斑马鱼基因组中找到，它们与人类对应物之间的总体氨基酸同一性在40％至96％之间。这种高度的保守性表明，与人类相比，斑马鱼的自噬途径以非常相似的方式运作，并促成了许多突变体和转基因自噬斑马鱼系的发展。尽管有明显的结构差异，斑马鱼的骨骼生理也与哺乳动物相似，包括相同的关节类型和关节组件，如关节腔、关节软骨和滑膜。已在经过广泛研究的斑马鱼幼虫颚中得到广泛的展示，并且仍然是用于模拟关节发育的主要关节部位之一。此外，强调脊椎动物骨骼分割、关节发育和鳍/肢发育的整体分子机制非常相似。可以在斑马鱼中模拟许多人类骨骼疾病，并且可以重现高等脊椎动物的表型。例如，在斑马鱼身上可以找到类似的疾病模型，如成骨不全、脊柱侧凸、骨质疏松症、Stickler综合征和骨关节炎。此外，由于斑马鱼在衰老过程中自然会发展成骨关节炎，因此该病的发病机制及其常见症状（例如脊柱畸形增加，椎骨脱位和骨折）以及骨赘的形成很容易探究。综上所述，这些数据表明，斑马鱼是具有代表性，相关性和有用的模型，可用于研究骨骼和关节发育，骨骼疾病的病理学以及任一过程中涉及的基因。
目前可用于研究斑马鱼自噬的工具：转基因和突变斑马鱼品系：鉴于人类和斑马鱼在遗传和生理上的相似性，在斑马鱼身上已经开发出多个针对关键自噬和骨骼基因的转基因和突变鱼系。尽管这些品系在各自领域内已被广泛用于研究，但将自噬品系和骨骼斑马鱼品系结合使用的研究却少得多。斑马鱼中产生的第一个转基因自噬报告基因是GFP-Map1Lc3和GFP-Gabarap转基因系，其报告基因在组成性巨细胞病毒（CMV）启动子的控制下表达。Map1Lc3和Gabarap都是酵母Atg8的同源物，并且各自在哺乳动物和鱼类中形成蛋白质的一个亚家族。在哺乳动物细胞中，MAP1LC3和GABARAP家族成员协同作用，使自噬体形成和/或物质识别，因此，在体内和体外测量自噬同样有用。总的来说，Map1Lc3是识别和可视化自噬活动最广泛使用的标记物。
GFP-Map1Lc3转基因斑马鱼品系如何用于研究骨骼环境中自噬的实例
GFP-Map1Lc3转基因斑马鱼品系已用于多项研究中，探讨自噬在细菌清除，鳍切除后形成胚泡和肝脏体内稳态中的作用。我们能够确定，在发育过程中，斑马鱼在关节部位周围表现出高表达的GFP-Map1Lc3，并且与周围细胞相比，关节间隙区的细胞特异性地显示出GFP-Map1Lc3的表达增加。考虑到斑马鱼的光学清晰度，这些鱼可以在麻醉下实时成像，并且Map1lc3的表达可以在同一条鱼的整个发育过程中被跟踪。此外，通过使用骨骼细胞特异性转基因系，GFP-Map1Lc3的表达可以与特定的细胞类型相关。例如，表达Col10a1或sp7的转基因系可用于标记不同分化阶段的成骨细胞；转基因GFPtrapfish可用于标记破骨细胞；而II型胶原的荧光标记可用于监测软骨细胞和软骨的发育和形成。
骨修复和再生测定：由于斑马鱼的鳍和鳞片在整个成年期都可以通过光学手段获得，斑马鱼为动态观察骨再生和骨修复的相关因素提供了一个有用的工具。与其他硬骨动物类似，斑马鱼可以在损伤后再生身体的某些部分。在鳍部，这种再生过程相对较快，在两周内，所有主要组织，包括骨骼、关节和神经都基本恢复。Varga等人使用鳍片再生试验，探索了自噬在此过程中的作用，并表明自噬的遗传和药理抑制作用会损害鳍的再生。这突出了自噬在组织构建和更新中的重要作用。对该过程的进一步研究可能有助于确定如何利用自噬来促进骨骼和软骨细胞的更新和替换，尤其是在衰老过程中。
使用GFP-Map1Lc3转基因斑马鱼品系研究自噬在鳍断裂修复和骨再生中的作用–顶部，示意图描绘了如何在斑马鱼中进行骨折修复和再生测定，以及如何使用茜素红在成年斑马鱼中进行活体骨染色。底部，受精后6个月在转基因CMV：EGFP-map1lc3b斑马鱼中进行的骨折修复测定的荧光立体显微镜图像用茜素红（红色）进行活体染色。
斑马鱼也是骨折修复研究的一个有用的模型，因为它们显示出骨折愈合反应伴随着骨痂的形成，这与哺乳动物非常相似。利用GFP-Map1Lc3系和活体骨染色茜素红，我们能够进行鳍部骨折分析，结果表明Map1Lc3在骨折修复的早期阶段表达增加。这表明自噬活性在修复反应中可能上调，并提示自噬在骨修复中的作用。
未来方向和结论：
现有的研究已经将斑马鱼作为研究脊椎动物发育和模拟遗传疾病（包括各种骨骼疾病）的有力模型。最近才在自噬研究中应用斑马鱼，但仍在增长，利用了斑马鱼提供的实时成像选项的易用性和可塑性，常用的啮齿动物自噬模型根本无法与之比拟。利用斑马鱼自噬模型进行的初步研究已经为自噬在骨骼细胞分化和功能、骨修复和再生以及药物研发中的作用提供了新的视角。
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